Resolución 255/98 del 23/10/98

INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS
Resolución 255/98
Metodología de análisis para determinar la calidad de los bulbos de ajo destinados a semilla.
Bs. As., 23/10/98
B.O.: 30/10/98
VISTO la necesidad de reglamentar la metodología de análisis para determinar la calidad de los bulbos de ajo destinados a semilla, y
CONSIDERANDO:
Que el artículo 6°, inciso ñ) del Decreto N° 2183/91 faculta al Organismo de Aplicación a fijar las normas de funcionamiento de los laboratorios de análisis de semillas.
Que la COMISION NACIONAL DE SEMILLAS en su reunión del día 14 de setiembre de 1998, Acta N° 256, dio su opinión favorable al respecto.
Que el DIRECTORIO DEL INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS en su reunión del día 25 de setiembre de 1998, Acta N° 50, dio su aprobación al proyecto.
Que la suscripta es competente para firmar el presente acto administrativo en virtud de lo dispuesto por el artículo 9°, inciso d) del Decreto N° 2817 del 30 de diciembre de 1991.
Por ello,
EL DIRECTORIO DEL INSTITUTO NACIONAL DE SEMILLAS
RESUELVE:
ARTICULO 1º. -Apruébanse las normas que establecen la metodología de análisis para determinar la calidad de los bulbos de ajo destinado a semilla, que como anexo forman parte de la presente resolución.
ARTICULO 2°. -Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese.
ANEXO
METODOLOGIA PARA ANALISIS DE SEMILLA DE AJO
1. MUESTRA QUE INGRESA AL LABORATORIO
Para análisis del virus del enanismo amarillo ("Onion Yellow Dwarf Virus, OYDV"), en la Clase Fiscalizada, categoría Básica, subcategoría Preinicial, ingresan al laboratorio muestras de una planta por descendencia de cada meristema (cultivo "in vitro") y para la subcategoría Inicial, muestras de 100 hojas por lote.
Para los análisis físicos, morfológicos y fisiológicos; la determinación de hongos, nematodos, eriófidos y OYDV, y a partir de la categoría Básica subcategoría Fundación, las muestras que ingresan al laboratorio son de 100 bulbos.
Las muestras se deben rotular, acondicionar evitando cualquier alteración del estado inicial de las mismas, ya sea por cambios de temperatura, humedad relativa, desprendimiento de tierra o trozos de tejido (4,5). El código de la muestra se registrará en el Formulario 1 o Libro de entrada, donde constarán los datos que identifican a las muestras.
2. ANALISIS FISICOS, FISIOLOGICOS, MORFOLOGICOS Y PUREZA VARIETAL
Estos análisis se realizan con la muestra de 100 bulbos. Los mismos se colocan sobre una superficie plana y bien iluminada que permita la observación comparativa y se evaluarán según el análisis de que se trate siguiendo los pasos de la Figura 1 y completando el Formulario 2.
2.1. Análisis de daños mecánicos
Los bulbos que muestren signos de daños mecánicos, ya sean causados por herramientas de cosecha como de manipuleo y transporte (independientemente de su magnitud) se recuentan y expresan su valor en porcentaje; luego se mezcla la totalidad de los bulbos y, nuevamente a partir de los 100 bulbos, se procede a la evaluación de la siguiente característica.
2.2. Análisis de daños fisiológicos
Los bulbos que muestren signos de daños fisiológicos como "parálisis cerosa", "decoloraciones", "agrietamiento del disco", "agrietamiento (cracking) de los bulbos", "escaldaduras" (independientemente de su magnitud) se recuentan y expresa su valor en porcentaje; luego se mezcla la totalidad de los bulbos y, nuevamente a partir de los 100 bulbos, se procede a la evaluación de la siguiente característica.
2.3. Análisis de defectos de forma
Los bulbos que manifiesten defectos tales como "ajo de dos pisos", "ajo pera", "ajo macho", "ajo rebrotado", "ajo martillo", "dientes extras", etc. (independientemente de su magnitud) se recuentan y expresa su valor en porcentaje; luego se mezclan nuevamente (5,6).
2.4. Pureza varietal (Bulbos fuera de tipo)
Los bulbos que no respondan al ideotipo de la variedad por presentar desviaciones se recuentan y expresa su valor en porcentaje; luego se mezcla la totalidad de los bulbos y, nuevamente a partir de los 100 bulbos, se procede a la evaluación de la siguiente característica.
2.5. Cálculo del calibre ponderado
Unicamente los bulbos con aptitud comercial como "semilla" (no se incluyen los que presenten defectos, ni anormalidades ni desvíos en su pureza varietal) se calibrarán siguiendo los valores consignados en la Tabla 1, utilizando el orificio de la calibradora con el límite superior de cada categoría. La placa calibradora deberá tener un espesor máximo de 8 mm.
Luego del recuento de unidades por calibre, el calibre ponderado se consigue a través de una media ponderada (suma de los productos entre el valor del calibre y el valor de la frecuencia correspondiente, dividida por el número total de bulbos analizados).
2.6. Cálculo del rendimiento potencial
El valor del calibre ponderado se corresponde a un determinado valor de peso, que surge de los ábacos preparados al efecto (Fig. 2 y 3) y se multiplica por la densidad declarada en campo por el inspector, a la que se le deberá restar el porcentaje correspondiente al total de defectos.
La cantidad de estampillas u obleas de certificación se entregarán de acuerdo al rendimiento potencial calculado por esta vía.
TABLA 1. Calibres de bulbo de ajo

CALIBRE		DIAMETRO TRANSVERSAL (mm)		ORIFICIO CALIBRADORA (mm)
3	26 a 35		35
4	36 a 45		45
5	46 a 55		55
6	56 a 65		65
7	66 a 75		75
8	76 a 85		85
9	más de 86		.

 
3. ANALISIS MICOLOGICO
Determinación de Helminthosporium allii Campanile (16,21), Fusarium spp.,(2,3,8) y Penicillium spp.(2).
La muestra para estos análisis se prepara extrayendo un "diente" de cada uno de los 100 bulbos.
Los 100 "dientes" destinados a estos análisis se preparan en 4 grupos de 25 unidades enteras (sin pelar ni cortar), las que se disponen separadas como mínimo 2 cm entre si, sobre 6 láminas de papel toalla de germinación (47 g/m2), humedecido con agua corriente, por única vez, a razón de 1 cm3/g de papel.
Las capas de papel, que deben mostrarse sin agua libre bajo presión dactilar, se disponen en una caja de tapa plástica transparente y/o bolsa de polietileno cristal de espesor inferior a los 30 micrones ("blotter test") (23).
Las cajas se incuban en cámaras climatizadas a 20ºC + 1º C durante 8 días con iluminación alternada (12 horas luz - 12 horas oscuridad).
La iluminación es provista por tubos de luz cercana al ultravioleta ("luz negra") (365 nm), separados 20 cm entre sí, colocados a 40 cm sobre las cajas. La utilización de luz negra es a los fines de favorecer la esporulación de los hongos aunque también se puede utilizar luz blanca de tubos fluorescentes comunes.
Luego del período de incubación prescripto se procede a la lectura de los diferentes hongos patógenos desarrollados sobre
los "dientes". El recuento de éstos se basa en la presencia o ausencia sobre cada unidad, anotando sobre el papel toalla, con lápiz acuarela, una letra que identifique a cada patógeno, y se expresa el resultado como proporción de dientes con presencia de los mismos (23). Los resultados se consignan en el Formulario 3.
4. ANALISIS DE NEMATODOS, ERIOFIDOS Y ACAROS
Están referidos a la presencia de Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev (Nematoda) (11,12,14,17), Aceria tulipae Keifer y Rhizoglyphus spp. (Acarina).
La muestra para estos análisis se prepara extrayendo un "diente" de cada uno de los 100 bulbos.
La muestra de 100 "dientes" se pesa, luego se pela hasta dejar expuesta la sustancia de reserva.
Las hojas de protección de los "dientes" se disponen sobre tamices de malla gruesa (" 9 mesh": orificio 2 mm, alambre 0,9 mm) y éstos dentro de embudos cuyo diámetro interno es de 160 mm, conectados en la parte inferior por un tubo de goma y una pinza de Mohr (1,7,25).
Los embudos se llenan con agua caliente (50º C), se tapan y se dejan 24 horas. Al cabo de este tiempo se extrae todo el líquido del embudo recogiéndolo en un vaso de precipitado.
El líquido se filtra a través de un tamiz de malla 325 (44 micrones) en el que quedan retenidos los nematodos, eriófidos y ácaros.
El contenido del tamiz se lava y se vierte en un frasco. Para eliminar la turbidez de la muestra, se agrega una cucharada (6 g) de caolín, se deja reposar 10 minutos y se centrifuga 5 minutos a 1800 unidades g.
El sobrenadante se desecha y se continua trabajando con el sedimento. Al mismo se le agrega una solución azucarada de densidad 1.18 y se centrifuga 2 minutos a 1700 unidades g. El sobrenadante se vuelca en tamiz de malla 325, se enjuaga con agua corriente para lavar el azúcar, y se coloca en frascos para luego realizar el recuento de los nematodos y eriófidos.
El análisis se realiza sobre toda la muestra, en cajas de vidrio (de petri) bajo lupa binocular (15 a 45x). Para facilitar el conteo se delimitan 8 sectores circulares, con marcadores indelebles.
Los resultados de la lectura se expresan en número de ejemplares de nematodos, eriófidos y ácaros por peso en 1000 gramos de muestra (Formulario 4).
5. ANALISIS VIROLOGICO
En la muestra de hojas o de "dientes", se realizará el análisis virológico optando por uno de los dos protocolos que se detallan a continuación:
PROTOCOLO 1. Desarrollo de la prueba inmunoenzimática de doble sandwich de anticuerpo (DAS-ELISA) para el diagnóstico de OYDV (Onion Yellow Dwarf Virus) (9,10,15,20,22,24,26).
1. Cobertura de la placa con inmunoglobina (Ig): Diluir la Ig a la dilución óptima (determinada en una placa de calibración) con el tampón de sensibilización (tampón "coating"). Colocar 200 microlitros de esa dilución en cada celdilla.
Cubrir la placa con polietileno para evitar deshidrataciones e incubar durante 4 horas a 37 ºC.
2. Lavado de la placa: Vaciar y lavar la placa, luego llenar las celdillas con tampón de lavado, dejar reposar tres minutos y vaciar la placa. Este procedimiento se repite tres veces.
3. Preparación y agregado de antígeno. Identificar las muestras y macerarlas con tampón de extracción en una relación peso/volumen adecuada (generalmente entre 1/2 a 1/10). Conservar a 4 ºC hasta su utilización. Luego de lavada la placa llenar las celdillas con 180 microlitros de cada muestra.
Las muestras se disponen en la placa según un modelo determinado previamente para su clara y rápida identificación.
Importante: Es necesario emplear 5 controles sanos diferentes, 2 enfermos y uno de tampón de extracción.
Mantener la placa a 4ºC durante 16 a 18 horas (toda la noche).
4. Lavado de la placa: Lavar la placa de la manera ya descripta hasta que no se observen restos vegetales (3 o más lavados) y en forma cuidadosa para evitar que el contenido de una celdilla pase a la otra.
5. Agregado del conjugado enzimático (Ig conjugada con fosfatasa alcalina): Diluir el conjugado, según la concentración previamente determinada, en tampon de conjugado (tampón enzima). Agregar 180 microlitros de esta dilución por celdilla. Cubrir la placa con polietileno para evitar deshidrataciones e incubar durante cuatro horas a 37oC.
6. Lavado de la placa: Lavar la placa como se describió, con la variante que el último lavado de este paso se realiza con tampón de sustrato.
7. Adición del sustrato.: . En el tampón de sustrato disolver entre 0,6 a 1 mg/ml de P-nitrofenilfosfato y colocar 200 microlitros en cada celdilla.
CUIDADO! EL P-NITROFENILFOSFATO ES CANCERIGENO. LOS TAMPONES EMPLEADOS TIENEN AZIDA SODICA. NO PONER EN CONTACTO CON LA PIEL.
Dejar la placa en oscuridad y realizar periódicamente lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm (nanometros).
Interpretación de los resultados
Se considera muestra enferma toda aquella que da un valor de absorbancia superior al promedio de los testigos sanos unas dos veces el desvio standar.
Los resultados del análisis se informan en el Formulario 5.

TAMPONES PARA DAS-ELISA
PBS (Tampón fosfato salino) (PBS) (g/l)
ClNa	8
KH2PO4	0,2
Na2HPO4	1,15
KCl	0,2
NaN3	0,2
Llevar a pH	6,8
Tampón de lavado (PBS + Tween)
PBS + 0,5 ml de Tween-20 / litro
Tampón de sensibilización ("tampon coating") (g/l)
Na2CO3	1,59
NaHCO3	2,93
NaN3	0,20
Llevar a pH	9,6
Tampón de extracción
PBS + Tween-20g	0,5 ml/l
PVP	20 g/l
Ovoalbúmina	10 mg/l
Tampón de conjugado (tampon enzima)
PBS + Tween-20	0,5 ml/l
PVP	29 g/l
Ovoalbúmina	2 g/l
Tampón de sustrato
Dietanolamina	97 ml
H20	800 ml
NaN3	0,2 g
Llevar a pH	9,8

PROTOCOLO 2. Desarrollo de la prueba ELISA- indirecto para potyvirus (18, 19)
1. Preparación de la muestra. La muestra se prepara extrayendo la savia en solución tampón de extracción en una relación de 1:10 (volumen de savia: volumen de tampón de extracción) o macerando tejido vegetal en tampón de extracción en la misma relación (peso de tejido: volumen de tampón de extracción). Colocar 100 microlitros de la muestra por celdilla. Utilice un marcador indeleble permanente para rotular cada placa con su número de análisis. Realice un diagrama de la localización de las muestras cuando llene la placa.
2. Incubación. Se sugiere incubar las placas en una cámara húmeda. Cuide que las mismas no permanezcan descubiertas durante la incubación.
3. Lavado. Las placas se deben lavar 3 a 5 veces con tampón fosfato más Tween, asegurándose que no queden restos vegetales en las celdillas antes del último lavado.
4. Preparación del anticuerpo. El anticuerpo concentrado debe diluirse según la recomendación del fabricante en tampón conjugado.
5. Incubación. Idem punto 2.
6. Lavado. Las placas deben lavarse con tampón fosfato más Tween, 4 a 8 veces.
7. Preparación del conjugado. El conjugado se prepara diluyendo el mismo en tampón conjugado a la dilución recomendada por el fabricante.
8. Incubación. Idem punto 2.
9. Lavado. Idem punto 6.
10. Preparación del sustrato. PNP (p-nitrofenil fosfato)- sustrato se prepara disolviendo las tabletas de PNP en PNP tampón a temperatura ambiente (ej., agregar una tableta de 5 mg de PNP por cada 5 ml de PNP tampón a temperatura ambiente). Disuelva completamente las tabletas antes de usar la solución. El PNP sustrato debe prepararse inmediatamente antes de usar. La solución sustrato no debe exponerse a la luz directa durante la incubación.
TENGA CUIDADO DE NO TOCAR LAS TABLETAS DE PNP.
11. Evaluación de los resultados. Aquellas celdillas donde se desarrolla color indican resultados positivos. Las celdillas con muestras negativas deberán permanecer sin color. Mientras las celdillas con controles negativos permanezcan sin color, debe permitirse que el PNP-sutrato reaccione durante más de 60 minutos para que se desarrolle color en las celdillas controles positivos. El número de testigos sugeridos por placa son los siguientes: Testigo sano: 2 celdillas; testigo enfermo: 2 celdillas y tampón de extracción: 2 celdillas.
Los resultados del análisis se informan en el Formulario 5.
TAMPONES PARA EL ELISA-INDIRECTO

Tampón fosfato salino (PBS)
Agua destilada	1L
ClNa	8 g
KH2PO4	0,2 g
Na2HPO4 12H2O	2,9 g
KCl	0,2 g
Llevar a pH	7,4
Tampón PBS - Tween
PBS	1L
Tween-20	0,5 ml
Tampón de extracción
Agua destilada 1L
PVP	20 g (2%)
NaCO3	1,59 g
NaHCO3	2,93 g
Tampón de conjugado
PBS + Tween	1L
PVP	20 g
Seroalbúmina bovina	0,2%
Tampón de sustrato
Dietanolamina	97 ml
H20	800 ml
CLH (hasta pH 9,8)

6. EXPRESION DE LOS RESULTADOS
El laboratorio deberá consignar la información de los análisis en el Certificado de Análisis (Formulario 6).
BIBLIOGRAFIA
1. BAERMANN, G. 1917. Eine einstache methode zur auffindung von Ankylostomum (Nematoden) larven in erdproben. Geneesk Tidschr. Ned. Indie, 57: 131-137.
2. BARNETT, H. L. & HUNTER, B. B. 1972. Illustrated genera of imperfect fungi. Burgers Publishing Company. Third Edition, 241 p.
3. BOOTH, C. 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycolo-gical Institute, Kew, Surrey, England, 240 p.
4. BURBA, J. L. y MAKUCH, María. 1989. Propuesta de técnicas analíticas para ajo "semilla". En: Curso/Taller sobre Producción, Comercialización e Industrialización de Ajo, 1º, La Consulta, Nov. 28-30. La Consulta, Mendoza, EEA La Consulta INTA. Agro de Cuyo, 45-46.
5. BURBA, J. L. 1989. Cosecha, preparación y almacenamiento de ajo "semilla". En: Curso/Taller sobre Producción, Co-mercialización e Industrialización de Ajo, 1º, La Consulta, Nov. 28-30. La Consulta, Mendoza, EEA La Consulta INTA. Agro de Cuyo, 25-27.
6. BURBA, J. L., J. ALEMANY, M. V. CID y R. B. A. de AZEVEDO. Anormalidades morfológicas en la bulbificación de ajo (Allium sativum L.). Rev. Cs. Agropec.,5: 45-55.
7. CAVENESS, F. E. & JENSEN, H. J. 1955. Modification of centrifugal flotation technique for the isolation and con-centration of nematodes and their eggs from soil and plant tissue. Proc. Helminthol. Soc. Wash., 22: 87-89.
8. CIPOLLA, G. 1955. Manchas de herrumbre del diente de ajo. (Fusarium cepae [Hanz.] em. Lk. et Bail.). IDIA 86: 30-32.
9. CLARK, M. F. and ADAMS, A. N. 1976. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked inmunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-482.
10. CLARK, M. F. LISTER, R. M. and BAR-JOSEPH, M. 1986. ELISA Techniques. Methods in enzymology Vol. 118:742-766.
11. DALMASSO, A. 1966. Méthode simple d"extraction des nématodes du sol. Rev. Ecol. Biol. Sol., 3: 473-478.
12. DEL TORO, M. S. y S. J. CASTELLANOS. 1992. Control de ácaros en ajo. En: Curso/Taller sobre Producción, Comercialización e Industrialización de Ajo, 2º, La Consulta, Nov. 28-30. La Consulta, Mendoza, EEA La Consulta INTA. Agro de Cuyo, Jornadas, 1. p. 89-92.
13. DEL TORO, M. S. 1989. Nematodo del tallo, del cuello y de los bulbos, Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev. Curso/Taller sobre Producción, Comercialización e Indus-trialización de Ajo, 2º, La Consulta, Nov. 28-30. La Consulta, Mendoza, EEA La Consulta INTA. Agro de Cuyo, Jornadas, 1. p. 9.
14. DOUCET, M. E. 1980. Ténicas básicas en nematología de suelo. IDIA, Marzo/Abril: 34-43.
15. ENGVALL, E. and PERLMAN, P. 1971. Enzyme linked inmunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of inmunoglobulin G. Inmunochemistry 8:871-874.
16. FREZZI, M. J., L. GIORDA y G. J. MARCH. 1974. Ajo cabeza negra (Helminthosporium allii, Campanile) en Córdoba, Argentina. IDIA 309-312: 1-5.
17. GOODEY, J. B. 1963. Laboratory methods for work with plant and soil nematodes. Tech. Bull. 2, Min. Agric. Fish. and Food.
18. JORDAN, R. and HAMMOND, J. 1986. Analysis of antigenic specifity of monoclonal antibodies to several potyviruses. Phytopathology 76:1091.
19. JORDAN, R. and HAMMOND, J. 1988. Epitope specificity of strain, virus, subgroup-specific and potyvirus cross reactive monoclonal antibodies. Phytopathology 78:1600.
20. MATTHEWS, R. E. F. 1991. Plant Virology. Academic Press, New York.
21. MESSIAEN, C. M. & LAFON, R. 1968. Enfermedades de las hortalizas. España, Oikos-Tau S. A., 361 p.
22. MOWAT, W. P. and DAWSON, S. 1987. Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera. J. Virol. Meth. 15:233-247.
23. NEERGAARD, P. 1977. Seed pathology. London, Unwin Brothers, Vol. 1, 839.
24. SANCHEZ_VIZCAINO, J. L. y ALVAREZ, M. C. 1981. Técnicas inmunoenzimáticas en patología animal y vegetal. Colección monográfica INIA 29, Madrid.
25. SEINHORST, J. W. 1952. Eennieuwe methode voor di bepaling van de vatbaarheid van roggeplanten voor aanstanting door stengelaaltjes - Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev. Tijdschr. Plantensiekten, 58: 103-108.
26. VOLLER A.; BARTLETT, A.; BIDWELL, D. E.; CLARK, M. F. And ADAMS, A. N. 1976. The detection of viruses by enzyme- linked inmunosorbent assay (ELISA). J. Gen. Virol. 33:165-167.
 
FIGURA 1. Diagrama del flujo de las muestras de semilla de ajo para análisis (a partir de Básica Fundación)
MUESTRA DE 100 BULBOS DE AJO
SEPARAR POR DAÑOS MECANICOS
(recuento)
SEPARAR POR DAÑOS FISIOLOGICOS
(recuento)
SEPARAR POR DEFECTOS DE FORMA
(recuento)
SEPARAR POR BULBOS FUERA DE TIPO
(recuento)
CLASIFICAR POR CALIBRE
(recuento)
informe
(reconstituir muestra de 100 bulbos)
(extraer tres "dientes" por bulbo)
uno para cada tipo de análisis
ANALISIS de H. allii, Fusarium y Penicillium
(con 100 "dientes")
ANALISIS de Ditylenchus dipsaci y Aceria tulipae
(con 100 "dientes")
ANALISIS de OYDV
(con 100 "dientes")
(1 placa por muestra)
NOTA: Los FORMULARIOS que conforman la presente pueden ser consultados en el Boletín Oficial del 30/10/98